Գրամի ներկումը արագ տեխնիկա է և օգտագործվում է հյուսվածքների նմուշում բակտերիաների առկայությունը տեսնելու և մանրէները գրամ-դրական կամ գրամ-բացասական դասակարգելու համար `հիմնվելով նրանց բջջային պատերի քիմիական և ֆիզիկական հատկությունների վրա: Գրամի բիծը գրեթե միշտ օգտագործվում է որպես բակտերիալ վարակի ախտորոշման առաջին քայլ:
Այս ներկման տեխնիկան անվանվել է դանիացի գիտնական Հանս Քրիստիան Գրամի (1853 - 1938) անունով, ով տեխնիկան մշակել է 1882 թվականին և հրապարակել այն 1884 թվականին ՝ որպես նմանատիպ կլինիկական ախտանիշներով երկու տեսակի բակտերիաների տարբերակման տեխնիկա ՝ Streptococcus pneumoniae (հայտնի է նաև որպես Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) և մանրէներ Klebsiella pneumoniae:
Քայլ
Մեթոդ 1 -ից 3 -ը ՝ Մանրադիտակի սլայդի պատրաստում
Քայլ 1. Պատրաստվեք աշխատել լաբորատորիայում:
Հագեք ձեռնոցներ և երկար մազերի փողկապ ՝ ձեր փորձարկվող նմուշի բակտերիալ աղտոտումից խուսափելու համար: Մաքրել աշխատանքային տարածքը ծխի կափարիչի տակ կամ մեկ այլ լավ օդափոխվող տարածքում: Սկսելուց առաջ ստուգեք Bunsen այրիչը և համոզվեք, որ մանրադիտակը ճիշտ է աշխատում:
Քայլ 2. Ստերիլիզացրեք մանրադիտակի ապակու սահիկը:
Եթե ապակու սահիկը կեղտոտ է, լվացեք այն օճառաջրով `յուղը և կեղտը հեռացնելու համար: Մաքրեք սլայդները էթանոլով, ապակու մաքրիչով կամ ձեր լաբորատորիայի կողմից օգտագործվող այլ եղանակով:
Քայլ 3. Նմուշը դրեք ապակու սահիկի վրա:
Դուք կարող եք օգտագործել Գրամի բիծի տեխնիկան ՝ բժշկական նմուշի բակտերիաների հայտնաբերման կամ Պետրիի ամանի մեջ աճող բակտերիաների մշակույթի օգնությամբ: Լավագույն արդյունքի հասնելու համար օգտագործեք Gram բիծը նմուշի բարակ հարվածների վրա: Samplesանկալի է օգտագործել նմուշներ, որոնք 24 ժամից պակաս են, քանի որ հին բակտերիաները կարող են վնասել իրենց բջիջների պատերը և չեն արձագանքում Գրամի ներկմանը:
- Եթե օգտագործում եք հյուսվածքի նմուշ, 1-2 կաթիլ ավելացրեք ապակու սահիկին: Հավասարաչափ տարածեք սահիկի վրա ՝ նմուշի ցողման բարակ շերտ ձևավորելով այն սահեցնելով մյուս ստերիլ ապակու սահիկի եզրով: Թող չորանա հաջորդ քայլը կատարելուց առաջ:
- Եթե դուք մանրէներ եք վերցնում Պետրիի ամանից, ստերիլիզացրեք պատվաստման օղակը Բունսենի այրիչում, մինչև այն պայծառանա, այնուհետև թողեք սառչի: Օգտագործեք օղակը `ստերիլ ջուրը կաթեցրեք սահիկի վրա, այնուհետև մանրէազերծեք և նորից սառեցրեք, նախքան այն օգտագործել մանրէների փոքր նմուշ հավաքելու համար: Դրանից հետո նրբորեն խառնել:
- Արգանակի մեջ պատրաստված բակտերիաները պետք է նորից խառնել պտտաձողի միջոցով, այնուհետև վերցնել պատվաստման օղակով, ինչպես վերևում, առանց ջուր ավելացնելու:
- Եթե ունեք շվաբրերի նմուշ (սովորաբար կատարվում է բամբակի ծայրով փոքր բռնակով), դիպչեք և նրբորեն պտտեք շվաբրը սահիկի վրա:
Քայլ 4. Մի փոքր բարձր ջերմաստիճանը կարող է լավ քսել:
Theերմությունը կպահի բակտերիաները սահիկի վերեւում, այնպես որ դրանք հեշտությամբ չեն լուծվում ներկման գործընթացում: Արագ հպեք սահիկին երկու -երեք անգամ Bunsen այրիչի վրա կամ տաքացրեք սահիկը էլեկտրական սլայդերի վրա: Մի տաքացեք, նմուշը կարող է վնասվել: Եթե դուք օգտագործում եք Bunsen այրիչ, այն պետք է լինի փոքր, բայց կապույտ բոց, մեծ նարնջագույն բոցի փոխարեն:
Այլապես, քսուքը կարող է պատրաստվել նաև մեթանոլով ՝ չոր կաթի վրա ավելացնելով 1-2 կաթիլ մեթանոլ, չորացնելով մնացած մետանոլը սահիկի վրա ՝ թողնելով այն բաց երկնքի տակ: Այս տեխնիկան նվազագույնի է հասցնում բջիջների վնասը և ապահովում է պատկերների մաքուր ֆոն:
Քայլ 5. Տեղադրեք սահիկը գունազարդման սկուտեղի վրա:
Գունավոր սկուտեղները պատրաստված են մետաղից, ապակուց կամ մակերեսային պլաստմասե ափսեներից, որի վերին հատվածը փափուկ ցանց է: Տեղադրեք սլայդները այս ցանցերի վերևում, որպեսզի ձեր օգտագործած հեղուկը թափվի սկուտեղի մեջ:
Եթե դուք չունեք գունազարդման սկուտեղ, կարող եք սլայդ տեղադրել պլաստիկ սկուտեղի վրա `սառույցի կտորներ տպելու համար:
Մեթոդ 2 3 -ից. Գրամի բիծի գործընթաց
Քայլ 1. Քսուքի վրա լցնել բյուրեղյա մանուշակագույն հեղուկը:
Պիպետով մանրէների նմուշը ցողեք մի քանի կաթիլ բյուրեղյա մանուշակագույն ներկով, որը հայտնի է նաև որպես ջենտիան մանուշակ: Թողեք այն 30-60 վայրկյան: Բյուրեղյա մանուշակը (KV) ջրային լուծույթում բաժանվում է KV+ և քլորիդի (Cl-) իոնների: Այս իոնները ներթափանցում են ինչպես գրամ-դրական, այնպես էլ գրամ-բացասական բակտերիաների բջջային պատեր և բջջային թաղանթներ: KV+ իոնը փոխազդում է բակտերիալ բջիջների բացասական լիցքավորված բաղադրիչների հետ ՝ բջիջներին տալով մանուշակագույն գույն:
Շատ լաբորատորիաներում օգտագործվում է «Հաքեր» բյուրեղյա մանուշակ, որը պարունակում է ամոնիումի օքսալատ `տեղումները կանխելու համար:
Քայլ 2. Մեղմորեն լվացեք բյուրեղյա մանուշակը:
Թեքեք սահիկը և լվացքի շիշով սահեցրեք թորած կամ ծորակի փոքր հոսք սահիկի վրա: Waterուրը պետք է հոսի արատով և չպետք է ուղղակիորեն ցողել քսուքին: Չափից դուրս մի ողողեք: Այն կարող է հեռացնել Գրամ դրական բակտերիաների ներկումը:
Քայլ 3. Լվանալ յոդով, ապա լվանալ:
Կաթիլը քսեք յոդով: Թողեք այն առնվազն 60 վայրկյան, այնուհետև մանրակրկիտ լվացեք այնպես, ինչպես վերևում է: Յոդը, բացասական լիցքավորված իոնի տեսքով, փոխազդում է KV+-ի հետ ՝ բյուրեղյա մանուշակի և յոդի միջև կազմելով մեծ բարդ համալիր (CV-I բարդ համալիր)) բջջի ներքին և արտաքին շերտերում: Միացությունների այս համալիրը կպահպանի բյուրեղյա մանուշակի մանուշակագույն գույնը բջիջի ներսում ՝ ներկված տեղերում:
Յոդը քայքայիչ նյութ է: Խուսափեք ինհալացիաից, կուլ տալուց կամ մաշկի հետ շփումից:
Քայլ 4. Ավելացրեք գունավոր սպիտակեցում, այնուհետև արագ լվացեք:
Սովորաբար այս կարևոր քայլի համար օգտագործվում է ացետոնի և էթանոլի 1: 1 խառնուրդ, որը պետք է զգուշորեն ժամանակին սահմանվի: Տեղադրեք սահիկը որոշակի անկյան տակ, այնուհետև ավելացրեք գունաթափիչ նյութ, մինչև որ ավելի շատ մանուշակագույն տեսանելի լինի լվացման համար օգտագործվող ջրի մեջ: Սովորաբար դա տևում է ավելի քան 10 վայրկյան, կամ նույնիսկ ավելի քիչ ժամանակ, եթե սպիտակեցնող նյութը պարունակում է ացետոնի բարձր կոնցենտրացիա: Անմիջապես դադարեցրեք այս քայլը, հակառակ դեպքում ներկը նույնպես բյուրեղյա մանուշակը կլանի գրամ-դրական և բացասական բջիջներից, և ներկման գործընթացը պետք է կրկնվել: Անմիջապես լվացեք ցանկացած ավելորդ գույնի սպիտակեցում ՝ օգտագործելով նախորդ տեխնիկան:
- Մաքուր ացետոնը (95%+) կարող է օգտագործվել որպես փոխարինող: Որքան ավելի շատ ացետոն օգտագործեք, այնքան ավելի արագ կգործի սպիտակեցումը, այնպես որ դուք պետք է ավելի շատ ուշադրություն դարձնեք ժամանակին:
- Եթե դժվարանում եք հետևել այս քայլի ժամանակին, կաթիլ առ կաթիլ ավելացրեք գույնի սպիտակեցնող նյութեր:
Քայլ 5. Հակաթարմ ներկը ցանել քսուքին, ապա լվանալ:
Հակաքայլը, սովորաբար սաֆրանինը կամ ֆուկսինը, օգտագործվում է գրամ-բացասական և գրամ-դրական բակտերիաների հակադրությունը բարձրացնելու համար `գունազրկված (գունազերծված) բակտերիաների, այսինքն` գրամ-բացասական, վարդագույն կամ կարմիր բակտերիաների ներկման միջոցով: Թողեք առնվազն 45 վայրկյան, ապա լվանալ:
Ֆուկսինը ինտենսիվորեն կաղտոտի բազմաթիվ գրամ-բացասական բակտերիաներ, օրինակ ՝ Haemophilus spp և Legionella spp: Այս մեթոդը լավ է սկսնակների համար:
Քայլ 6. Չորացրեք սահիկը:
Դուք կարող եք դրանք չորացնել բաց երկնքի տակ կամ չորացնել դրանք օգտագործելով այս նպատակով վաճառվող աստվածաշնչյան թուղթը: Gram- ի ներկման գործընթացն ավարտված է:
Մեթոդ 3 3 -ից. Գունազարդման արդյունքների ստուգում
Քայլ 1. Պատրաստեք լուսային մանրադիտակը:
Տեղադրեք սահիկը մանրադիտակի տակ: Մանրէները մեծապես տարբերվում են չափերով, ուստի պահանջվող ընդհանուր խոշորացումը կտատանվի 400x- ից 1000x: Ավելի հստակ պատկերի համար խորհուրդ է տրվում ընկղմման յուղով օբյեկտիվ օբյեկտիվ: Ընկղմվող յուղը գցեք սահիկի վրա ՝ կաթիլներից խուսափելով շարժվելուց ՝ պղպջակների ձևավորումը կանխելու համար: Տեղափոխեք ոսպնյակի ոսպնյակի բռնակն այնպես, որ օբյեկտիվ ոսպնյակը տեղից բռնի և դիպչի յուղին:
Յուղի ընկղմումը կարող է օգտագործվել միայն հատուկ նախագծված ոսպնյակների վրա, այլ ոչ թե «չոր»:
Քայլ 2. Փորձեք բացահայտել գրամ դրական և գրամ բացասական բակտերիաները:
Ուսումնասիրեք սահիկը թեթև մանրադիտակով: Գրամ-դրական բակտերիաները հայտնվում են մանուշակագույն գույնի մեջ, քանի որ բյուրեղյա մանուշակը թակարդված է բջջի հաստ պատի ներսում: Գրամ-բացասական բակտերիաները կլինեն վարդագույն կամ կարմիր գույն, քանի որ բյուրեղյա մանուշակը ողողվում է բջիջների բարակ պատերի միջով, որտեղ մտնում է վարդագույն հականերկը:
- Եթե նմուշը չափազանց հաստ է, արդյունքը կարող է լինել կեղծ դրական: Ներկեք նոր նմուշ, եթե այն ցույց է տալիս բոլոր գրամ դրական բակտերիաները `համոզվելու համար, որ արդյունքը ճիշտ է:
- Եթե չափից շատ գունավոր սպիտակեցնող միջոց եք օգտագործում, արդյունքը կարող է լինել կեղծ բացասական: Ներկեք նոր նմուշ, եթե այն ցույց է տալիս բոլոր գրամ -բացասական բակտերիաները `համոզվելու համար, որ արդյունքը ճիշտ է:
Քայլ 3. Համեմատեք ձեր տեսած արդյունքները հղման պատկերի հետ:
Եթե չգիտեք, թե ինչ տեսք ունեն բակտերիաները, ուսումնասիրեք տեղեկատուների հավաքածուն ՝ սովորաբար տեսակավորված ըստ ձևի և Գրամի բիծ: Կարող եք նաև առցանց տվյալների շտեմարաններ դիտել [Ազգային մանրէաբանական ախտածին տվյալների շտեմարան, Լուսանկարներում մանրէներ և բազմաթիվ այլ առցանց կայքեր: Ստորև բերված են այն բակտերիաների օրինակները, որոնք սովորաբար հանդիպում են կամ կարևոր են ախտորոշման համար `դասակարգված ըստ իրենց Գրամի կարգավիճակի և ձևի:
Քայլ 4. Բացահայտեք գրամ-դրական բակտերիաները ՝ դրանց ձևի հիման վրա:
Մանրէների տակ մանրէները հետագայում դասակարգվում են ըստ իրենց ձևի ՝ առավել հաճախ որպես կոկսի (գնդաձև) կամ ձողեր (գլանաձև): Ահա գրամ-դրական բակտերիաների (մանուշակագույն գույնի) մի քանի օրինակ `ըստ իրենց ձևի.
- Գրամ դրական կոկիկներ սովորաբար ստաֆիլոկոկներ (նշանակում է ՝ կոկսի խումբ) կամ ստրեպտոկոկներ (նշանակում է շղթայական կոկիկ):
- «Գրամ դրական ձողեր, ինչպիսիք են Bacillus, Clostridium, Corynebacterium և Listeria: Ձողային բակտերիաներ Actinomyces spp. սովորաբար ունենում են ճյուղեր կամ թելեր:
Քայլ 5. Բացահայտեք գրամ -բացասական բակտերիաները:
Գրամ-բացասական բակտերիաները (վարդագույն գույնով) հաճախ դասակարգվում են երեք խմբի. Կոկերը գնդաձև են, ձողերը ՝ երկար և բարակ, իսկ կոկոիդ ձողերը ՝ միջնամասում:
- Գրամ -բացասական կոկիկներ Ամենատարածվածը Neisseria spp է:
- Գրամ-բացասական ձողեր օրինակ ՝ E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas և շատ ուրիշներ: Vibrio cholerae- ն կարելի է դիտել որպես սովորական ցողուն կամ ծռված ցողուն:
- Գրամ-բացասական «կոկոիդ» (կամ «կոկոբացիլներ») ձողերի մանրէներ օրինակ ՝ Բորդետելլան, Բրյուսելան, Հեմոֆիլուսը և Պաստերելլան
Քայլ 6. carefullyգուշորեն ստուգեք, արդյոք արդյունքները խառնվում են:
Որոշ մանրէներ դժվար է ճշգրիտ գունավորել ՝ բջիջների պատերի փխրունության կամ մոմե բնույթի պատճառով: Այս բակտերիաները կարող են ցույց տալ մանուշակագույն կամ վարդագույն խառնուրդ նույն բջիջում կամ նույն բջջի տարբեր բջիջների միջև: 24 ժամից ավելի հին բակտերիաների նմուշները կարող են ցույց տալ այս խնդիրը, սակայն կան նաև որոշ բակտերիալ տեսակներ, որոնք դժվար է գունավորվել ցանկացած նմուշառման տարիքում: Այս բակտերիաները պահանջում են նույնականացման ավելի մասնագիտացված թեստեր, ինչպիսիք են թթվային արագ ներկումը, մանրէային մշակույթում դիտարկումը, TSI մշակույթի միջավայրը կամ գենետիկական փորձարկումը:
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, and Propionibacterium spp. բոլորը գրամ-դրական բակտերիաներ են, բայց հաճախ հստակ ներկված չեն:
- Փոքր, բարակ մանրէներ, ինչպիսիք են Treponema- ն, Chlamydia- ն և Rickettsia spp- ն: դժվար է ներկել Գրամի մեթոդով:
Քայլ 7. Մնացեք մնացած սպառման նյութերն ու սարքավորումները:
Թափոնների հեռացման այս ընթացակարգը տարբերվում է լաբորատորիաներից և կախված է օգտագործվող նյութերից: Սովորաբար, ներկող սկուտեղի հեղուկը թափվում է շշերի մեջ, որոնք պիտակավորված են որպես վտանգավոր թափոններ: Ներծծեք սահիկները 10% սպիտակեցնող լուծույթի մեջ, ապա թափեք կտրուկ տարայի մեջ:
Խորհուրդներ
- Հիշեք, որ Gram բիծի արդյունքները լավ կլինեն միայն այն դեպքում, եթե նմուշը լավն է: Կարևոր է տեղեկացնել հիվանդներին, որպեսզի նրանք կարողանան լավ նմուշ տրամադրել (օրինակ ՝ թուքից և խոր հազի տարբերությունը թուքից նմուշ ստանալու համար):
- Որպես գունային սպիտակեցում, էթանոլը ավելի դանդաղ է արձագանքում, քան ացետոնը:
- Պահպանեք ստանդարտ լաբորատոր կանոնակարգերը `անվտանգությունն ապահովելու համար:
- Practiceբաղվելու համար օգտագործեք այտերի շվաբր, քանի որ այն պարունակում է ինչպես գրամ-դրական, այնպես էլ գրամ-բացասական բակտերիաներ: Եթե տեսնում եք միայն մեկ տեսակի բակտերիաներ, գուցե շատ քիչ կամ շատ սպիտակեցնող միջոց եք օգտագործում:
- Սահիկը ամրացնելու համար կարող եք օգտագործել փայտե ճարմանդներ:
Գուշացում
- Ացետոնը և էթանոլը դյուրավառ նյութեր են: Ացետոնը ձեր ձեռքերից կհեռացնի յուղը ՝ ձեր մաշկի համար ավելի հեշտ կլանելով այլ քիմիական նյութեր: Հագեք ձեռնոցներ և օգտագործեք դրանք խնամքով:
- Թույլ մի տվեք, որ արատը չորանա, նախքան ողողել գրամի բիծը կամ հակաթույնը:
Այն, ինչ ձեզ հարկավոր է
- Networkանցի նմուշ
- Ապակե սահիկ
- Պիպետ
- Փոքր հրդեհի աղբյուր, կամ սահիկ տաքացուցիչ կամ մեթանոլ
- Ուր
- Բյուրեղյա մանուշակագույն
- Յոդ
- Գունավոր սպիտակեցնող նյութեր, ինչպիսիք են ալկոհոլը կամ ացետոնը
- Սաֆրանին
